一、实验技术流程
1、核体系酵母双杂筛库
1）自激活检测；
a、从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于4mL的YPDA液体培养基中，30℃，225×g，振荡培养18-20h，至OD600>1.5，一般为4左右；
b、转接YPDA液体培养基，培养体积为50mL，使初始OD600=0.2，30℃，225×g，振荡培养4-5h，至OD600=0.6；
c、离心收菌，室温，4,000×g，5min；
d、用20mL无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000×g，5min，弃上清；
e、用5mL 0.1MLiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000×g，5min，弃上清；
f、用500μL 0.1MLiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5mL离心管，每个50μL（每个转化），备用；
g、每个1.5mL离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀；
h、30℃水浴孵育，30min； 42℃水浴热激，25min；30℃水浴复苏，30min；
i、离心收菌，室温，4,000×g，5min，弃上清；
j、每个转化用200μL无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板；
k、30℃恒温培养4d。
2）文库筛选；
用含有正确pGBKT7-Bait诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌制备感受态，将某物种酵母双杂交核文库质粒转入其中，涂TDO/X平板。步骤与自激活检测类似。
3）阳性克隆验证；
从上述TDO/X平板上挑取所有蓝色的克隆，用生理盐水重悬后，点板于QDO/X平板，30℃培养5-7d。从上述QDO/X平板中选取蓝色的克隆进行菌落PCR扩增，并电泳检测，将扩增的目的条带回收后送测序，并分析比对测序结果。
2、核体系酵母单杂筛库
1）诱饵载体Y1H Gold重组菌株的构建；
a、线性化重组质粒：使用Takara公司的限制性核酸内切酶BbsⅠ或者BstBI对pBait-AbAi进行酶切反应；
b、Y1H Gold酵母菌株于YPDA固体培养基上划线，30℃倒置培养3~5d左右，分离单菌落；
c、挑取培养好的2~3个单菌落分别在3mL YPDA液体培养基中，30℃ 250×g摇床培养8~12h，震荡试管能看到浓稠的白色菌体即可；
d、取5μL上述新鲜菌液于50mL新的YPDA液体培养基中，250×g摇床上30℃培养至OD600值0.15~0.3，大致需要16~20h；
e、700×g室温离心5min，去上清，用1mL新鲜YPDA液体培养基将菌体重悬后加入到新的100mL YPDA液体培养基中，30℃摇床250×g培养至OD600为0.4~0.5；
f、将上述摇好的新鲜菌液平均分为两份，室温750×g离心5min，去掉上清，用30mL无菌水重悬菌体；
g、室温700×g离心5min，去上清收集菌体，用1.5mL 1×TE/LiAc溶液重悬菌体并转移至无菌15mL Ep管中；
h、高速瞬时离心10s，去上清，每管菌体用600μL 1×TE/LiAc溶液重悬菌体；
i、取100μL酵母感受态细胞，按比例加入样品试剂配制共转化体系。在混匀的共转化体系中加入500μL PEG/LiAc溶液轻轻混匀，30℃水浴45min，每隔15min轻柔混匀样品；
j、在其中加入20μL DMSO混匀，42℃水浴20min后室温700×g离心5min，弃上清，菌体用1mL YPDA液体培养基重悬；
k、室温700×g离心5min去上清，用400μL无菌水重悬菌体，取100μL菌液涂布SD/-Ura固体培养基，30℃恒温倒置培养3d。
3、阳性重组酵母菌株的筛选与鉴定
1）酵母重组菌株的AbA最低浓度测定；
选用阳性菌株在SD/-Ura固体培养基上划线30℃倒置培养3d，新鲜的酵母细胞在4℃可以保存1个月。严谨性验证的步骤如下：
a、挑取培养基上的单菌落用3mL的SD/-Ura培养基30℃摇床培养14h，700×g常温离心5min收集菌体；
b、菌体用无菌水重悬，调整OD600至0.2后取1μL菌液加无菌水稀释100倍；
c、把所有稀释后的酵母菌液分别涂布到SD/-Ura、SD/-Ura with AbA（100ng/mL）、SD/-Ura with AbA（150ng/mL）、SD/-Ura with AbA（200ng/mL）的固体培养基上30℃倒置培养3d，观察平板上菌落的生长情况。
注：如果200 ng/mL的AbA浓度不足以抑制pBait-AbAi和p53-AbAi重组菌株的基础表达，可以调整AbA浓度上限直至1000 ng/mL。
2）文库筛选；
使用诱饵基因重组酵母菌株作为受体材料，制备感受态细胞。把文库质粒转入制备完成的酵母感受态细胞中。每250μL的菌液涂布在一个SD/-Ura-Leu + AbA培养基上，30℃倒置培养3~5d，观察转化结果，记录转化效率。
3）阳性克隆验证。
从SD/-Ura-Leu + AbA培养基平板中选取单克隆菌落进行菌落PCR扩增，并电泳检测，将扩增的目的条带回收后送测序，并分析比对测序结果。
二、实验重难点
培养条件，如温度和湿度等条件不正确会影响酵母菌落的生长；酵母菌接种量接种的酵母细胞数量太少，可能会导致菌落生长缓慢；培养基的成分或pH值不正确，可能会影响酵母菌落的生长。
三、与其他同类型实验相比优势与劣势
在拥有酵母文库的前提下，酵母筛库相比于IP-MS更加的方便，而且一次建库，可以多次使用，用于不同的转基因筛选。
四、我司该实验业务优势
1、严谨的实验过程；
2、严格的结果把控；
3、丰富的项目经验。
五、常见问题答疑
1、筛选培养基上克隆太多的可能原因有哪些？
A：可能原因：可能诱饵蛋白存在自激活，自身就可以激活下游筛选标记的表达；或者是筛选条件过于宽松。
解决办法：选用更为严格的筛选条件抑制诱饵蛋白的自激活活性，如果效果不理想，可以删除诱饵蛋白能够引起自激活活性的结构域，再用于酵母双杂交实验。
2、筛选培养基上克隆太少的可能原因有哪些？
A：可能原因：酵母杂交效率低、筛选条件太严格或与目的蛋白相互作用的蛋白太少。
解决办法：延长杂交时间，提高杂交效率；放宽筛选条件；与目的蛋白相互作用的蛋白太少是诱饵蛋白本身结构造成的，无法通过实验来弥补。
3、筛到的蛋白经测序后，为什么从AAA后翻译的结果有好多都移码？
A：三框文库不是不移码，而是保证您的文库中的每个基因的克隆都至少有一种不移码的情况存在，即您的文库表达的目的蛋白中总有正确的蛋白存在。 所以出现移码情况需要分析测序峰图而不是只看测序结果，也许峰图上有某个位点缺失导致序列移码，这种情况需要手动调整序列。理论上肯定只有不移码的基因才会被筛选出来。